本发明公开了一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料及其制备方法与应用。所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量为0.20~0.52MPa,干态压缩模量为2.27~6.76MPa,所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料具有人工构建的直径大于500μm的纵向大孔,在纵向大孔周围各向分布有直径为2~500μm的微孔。本发明复合材料具有较高的结晶性、较好的生物学性能、降解速率可调、合适的力学性能,具有类似人体骨的内部孔洞结构,能够起到促进骨组织再生的作用;并具有的大孔结构更有利于神经和血管的长成和营养物质输送。
1.一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料,其特征在于,所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量为0.20~0.52MPa,干态压缩模量为2.27~6.76MPa,所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料具有人工构建直径为1~1.5mm的纵向大孔,在纵向大孔周围各向分布有直径为2~500μm的微孔结构,所述微孔之间具有一定连通性。
2.权利要求1所述的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将致孔剂溶液与壳聚糖溶液按(1:4)~(1:5)的体积比混合,得到混合液,然后将混合液浇筑到模具中,静置10~15min,得到初级材料;再将初级材料依次经-80°C储存24h、-70°C冷冻干燥24h得到初级支架材料,然后用质量浓度为5%的NaOH溶液中和、蒸馏水洗涤、-80°C储存24h和-70°C冷冻干燥24h,得到壳聚糖基体支架;(2)将步骤(1)得到的壳聚糖基体支架浸泡于聚乳酸/二氯甲烷溶液中,搅拌30~45min,然后静置6~12h,最后真空干燥,得到所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料;其中聚乳酸溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10~15倍;聚乳酸/二氯甲烷溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10~15倍;步骤(1)中所述模具为中间大孔圆柱体模型,模具中心设有一中心孔洞,中心孔洞周围分布有若干个呈中心对称的孔洞,中心孔洞和孔洞的直径为1~1.5mm。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述的壳聚糖溶液的质量浓度为3%~6%。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述壳聚糖溶液通过以下制备方法得到:将壳聚糖加入到体积浓度为2%~4%的乙酸溶液中以25~30r/min搅拌6~8h,得到所述壳聚糖溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述致孔剂溶液为NaHCO₃溶液和/或Na₂CO₃溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述NaHCO₃溶液的质量浓度为5%~10%;所述Na₂CO₃溶液的质量浓度为8%~10%。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的聚乳酸/二氯甲烷溶液中聚乳酸的质量浓度为3%~6%,所述聚乳酸分子量为10万。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的真空干燥温度为35°C,真空度为-1atm,干燥时间为12h。技术领域
本发明属于引导骨组织再生领域,具体涉及一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
组织工程是近几十年来发展起来的一门新兴学科,是指应用生命科学与工程的原理及方法构建一个生物装置来维护和促进人体细胞和组织的生长,从而恢复、维持或提高受损组织或器官的功能。在组织工程的构建过程中,最重要的三个要素是支架材料、种子细胞与信号引导。支架材料主要是为细胞提供一个稳定的生长空间和代谢场,在信号的引导作用下,种子细胞进行特异性分化和进一步增殖,最终构建成完整的体系。理想的支架材料应该在具有一定力学性能的同时,同时兼有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点,并能够精确的控制材料的降解时间、孔隙率以及孔径等性能,依照不同的用途,材料可以在一定的诱导能力下塑造成各种形状与结构,并具备不同硬度和降解时间,以适合组织支架的需求。同时,选择合适的种子细胞也是组织工程的研究重点之一,组织工程的最初期的设想就是通过切取一小块正常同源组织,通过体外培养构建出新的组织块用以修复缺损部位,但是多项研究显示成熟细胞在体外扩增非常困难,细胞很难进一步的增殖分化,无法满足组织构建的需求。近年来,各种干细胞分离培养的成功案例为组织工程中种子细胞的研究带来了新的希望。间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化潜能、自我更新、免疫调控的成体干细胞,通过在在体内或体外培养、增殖、诱导后转化为多种组织细胞。目前的实验和临床研究中MSCs的主要来源是骨髓,但其存在有自身局限性。1、成人骨髓源MSCs的细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄的增大而下降;2、病毒感染率较高,且供者MSC的采集须行骨髓穿刺术,来源受到限制。有研究报道脐带中具有丰富的MSCs,且干细胞更原始,有更强的增殖分化能力易于获得,具有多向分化的能力,很少有肿瘤细胞、病原微生物的感染和传播,安全性高伦理问题争议少因此在组织工程研究中将脐带间充质干细胞(UC-MSC)作为种子细胞具有更为广阔的前景。退化性腰椎疾病,主要是指由椎间盘突出、腰椎滑脱、髓核突出等因素导致的腰椎位移、关节退变、神经功能损伤等腰椎疾病。自从Hibbs和Atbee与1911年首次提出脊柱融合(spinalxa0fusion)的概念以来,脊柱融合逐渐成为脊柱外科领域的一种常规治疗手段,广泛应用与许多脊柱疾病的治疗。近年来,脊柱融合术在骨科手术中实施的频率越来越高,据报道,目前美国每年有超过20万例的此类手术,而相应的对骨材料的需求也是越来越多。由于自体骨来源有限,且自体取骨通常会给患者带来巨大的痛苦和额外的并发症,因此在它的应用中受到了极大的限制。为了提高融合率和临床疗效,研究者们结合多种外科观点开发出了多种植骨替代材料。目前常见的植骨替代材料包括:同种异体骨、脱钙骨基质、无机植骨材料、金属材料,高分子材料。理想的植骨替代材料不但应该像自体骨那样具备成骨活性、骨诱导性以及骨传导性,此外还应该具备一定的生物活性和足够的力学支撑。在脊柱融合材料的应用中,对脊柱融合材料还应具有高于椎间盘间应压力的机械强度要且材料在植入后具有一定的稳定性无明显位移。随着材料科学的迅猛发展,新型材料不断应用于椎间融合术的应用中,近年来,随着组织工程学的发展,生物复合材料不断得到探索和利用,其既能提供术后即刻稳定性又能与椎体间形成永久性骨融合,这已经成为了椎间融合植入材料的重点研究方向。现有的壳聚糖支架强度低、孔径小,聚乳酸支架脆性大、细胞亲和性差。为改进上述缺点,现有技术中也有较多关于使用聚乳酸与壳聚糖复合制备支架材料的研究,例如公开号为101979103A的专利申请中公开了一种多孔组织工程支架的制备方法,其研究是通过材料与致孔剂的结合来构建一种生物多孔支架材料,并具体公开了以下步骤:称取高分子生物材料,加入溶剂二氯甲烷或三氯甲烷进行溶解;然后加入造孔剂NaHCO₃或Na₂CO₃的水合物粒子或两者的混合粒子并搅拌均匀,再将混合物倒在平铺的玻璃上,流延成膜,在半干状态下将膜加入到模具中,压制成型;将成型的样品通风干燥;再将样品用强酸浸泡,然后用去离子水水洗、浸泡,真空干燥即得聚合物支架。该专利申请中利用聚乳酸、壳聚糖、造孔剂NaHCO₃、二氯甲烷等原料进行制备多孔组织工程支架,但加入NaHCO₃/Na₂CO₃水合物颗粒作为致孔剂,容易导致NaHCO₃/Na₂CO₃颗粒在材料的制备过程中因为自身重力而下沉到溶液的底部,造成材料孔洞结构不均匀,导致局部孔洞结构过密、孔径过大。其次,以颗粒物作为致孔剂需要的沥滤时间相对来说会更长一些。最后,其中使用的常温干燥方式,过程缓慢,且水分蒸发会导致材料局部收缩影响整体效果。研究表明材料表面的多级微孔结构和蜂窝状结构有利于控制细胞行为,而孔径大于500μm则适合成骨细胞的分化、神经化和血管化。另外营养物质和代谢物的输送不足往往是阻碍中后期细胞增殖和组织再生的主要问题。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料。本发明的另一目的在于提供上述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的应用。为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料,所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量为0.20~0.52MPa,干态压缩模量为2.27~6.76MPa,所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料具有人工构建直径为1~1.5mm的纵向大孔,在纵向大孔周围各向分布有直径为2~500μm的微孔结构,所述微孔之间具有一定连通性,孔隙率达85%~95%。上述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法,包括以下步骤:(1)将致孔剂溶液与壳聚糖溶液按(1:4)~(1:5)的体积比混合,得到混合液,然后将混合液浇筑到模具中,静置10~15min,得到初级材料;将初级材料依次经-80°C储存24h、-70°C冷冻干燥24h得到初级支架材料,然后用质量浓度为5%的NaOH溶液中和、蒸馏水洗涤、-80°C储存24h和-70°C冷冻干燥24h,得到壳聚糖基体支架;(2)将步骤(1)得到的壳聚糖基体支架浸泡于聚乳酸/二氯甲烷溶液中,搅拌30~45min,然后静置6~12h,最后真空干燥,得到所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料;其中聚乳酸溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10~15倍;聚乳酸/二氯甲烷溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10~15倍。所述壳聚糖基体支架体积通过模具注水量估算出。优选的,步骤(1)中所述模具为中间大孔圆柱体模型,模具中心设有一中心孔洞,中心孔洞周围分布有若干个呈中心对称的孔洞,中心孔洞和孔洞的直径为1~1.5mm。优选的,步骤(1)中所述的壳聚糖溶液的质量浓度为3%~6%。更优选的,所述壳聚糖溶液通过以下制备方法得到:将壳聚糖加入到一定体积浓度的乙酸水溶液(体积浓度为2%~4%)中以25~30r/min搅拌6~8h,得到所述壳聚糖溶液(质量浓度为3%~6%)。优选的,步骤(1)中所述致孔剂溶液为NaHCO₃溶液和/或Na₂CO₃溶液。更优选的,所述NaHCO₃溶液的质量浓度为5%~10%;所述Na₂CO₃溶液的质量浓度为8%~10%。优选的,步骤(2)中所述的聚乳酸/二氯甲烷溶液中聚乳酸的质量浓度为3%~6%,所述聚乳酸分子量为10万。优选的,步骤(2)中所述的真空干燥温度为35°C,真空度为-1atm,干燥时间为12h。上述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料在脊柱融合术中的应用。本发明的原理为:壳聚糖作为一种天然生物材料,具有良好的生物相容性及引导成骨组织爬行的能力,亲水性较好,但是力学支撑性能较差。而聚乳酸具有强度较佳和可控性降解的优点,但单纯的聚乳酸支架也存在脆性较大、降解产物呈酸性的缺点。本发明将两种材料结合起来,能够综合两种材料的优势,改善两种材料单独使用时存在的缺点和不足,所得的生物复合支架形成了互穿网络结构,具有较好的生物相容性、可降解吸收性以及较高的力学性能和合适的分级多孔结构。本发明模拟莲藕的大孔贯通结构制备具有分级多孔结构的复合材料,大孔提供材料与宿主之间流畅的物质传输,微孔结构为细胞提供理想的锚点。与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:(1)本发明在复合材料的制备过程中,采用壳聚糖与聚乳酸的复合能够进一步提高单纯的壳聚糖力学性能不够的缺点,使其在腰椎融合术中起到一定的力学支撑作用,且聚乳酸所占的比重较低,避免产生大量聚乳酸降解产物呈酸性严重危害组织再生的风险。(2)本发明在壳聚糖基体制备过程中采用NaHCO₃、Na₂CO₃等的水溶液作为致孔剂,采用化学发泡的方法改进了壳聚糖支架的孔洞结构,通过控制致孔剂溶液浓度,制得壳聚糖基体支架具有2~500μm不同孔径的内部微孔及1~1.5mm的大孔结构,能够进一步促进细胞的粘附与增殖。(3)本发明复合材料具有较高的结晶性、较好的生物学性能、合适的力学性能、降解速率可调,具有类似人体骨的内部孔洞结构,能够起到促进骨组织再生的作用;并具有的大孔结构更有利于神经和血管的长成和营养物质输送。(4)本发明复合材料作为一种生物可降解材料,既消除了二次手术的风险又弥补了单独使用壳聚糖或单独使用聚乳酸的支架的降解周期以及降解产物中的问题。(5)本发明复合材料制备工艺简单,原料来源丰富,功能全面,具有很高的市场和研究价值。(6)本发明利用NaHCO₃或Na₂CO₃溶液做致孔剂能够与材料更好地结合,更有利于制备出均匀的多孔结构。本发明分级多孔复合材料,通过复合材料与脐带间充质干细胞(UC-MSC)结合,构建具备更高生物学性能的仿生复合体系。在整个的复合体系中,分级多孔复合材料具有开放的空隙和高度的空隙间连接,能够有利于细胞的黏附、增殖以及分化同时也能够为细胞和组织的生长提供特定的空间以及支撑作用,有利于种子细胞核组织的生长。(7)本发明采用-80°C的预冻温度和-70°C的冻干温度通过冷冻诱导相分离构建内部孔洞结构。预冻过程中,CS溶液(壳聚糖溶液)中水分子开始结晶,导致分相,水完全结晶后分相过程也就被冻结终止,水的结晶行为决定所形成支架孔的形态结构。预冻温度越高最终得到的材料孔径越大,反之则材料的孔径愈小,多次试验证明在预冻温度为-80°C左右时得到的孔洞大小最接近理想结构。此外-70°C的冻干温度能够保证物料顺利的升华与解吸以得到最终的支架材料。本发明制备方法中利用冷冻干燥的方法能够更彻底的去除材料内部含有的水分子;其次,由于冷冻干燥利用的是升华的原理,材料内部水分有固态直接变为气态挥发,因此干燥过程迅速对复合材料结构无影响。(8)本发明先将致孔剂溶液与壳聚糖溶液混合,能够更好地使物料进行充分的混合,避免由于致孔剂分布不均引起局部结构差异。此外,本发明的最终目的是制备一种支架材料,在宏观结构上具有一定的高度,若将致孔剂以颗粒的形式加入则会使得颗粒沉积底部,从而导致结构在整体上差异较大。其次,将致孔剂溶液加入到壳聚糖溶液中,也能利用壳聚糖溶液的粘稠性,将CO₂包裹在溶液内部以构建孔洞结构。(9)本发明选定的致孔剂溶液与壳聚糖溶液的体积比是(1:4)~(1:5),最终确定这样的物料比主要是因为,在材料的制备过程中比例太高会导致在原料共混过程中CO₂大量并迅速产生逸出材料,比例太低则会导致CO₂产生量过少达不到预期效果。(10)本发明所用模具是模拟莲藕茎制备的一种硅胶模具,选用此模具主要是为了构建出直径为1~1.5mm的的纵向大孔,促进营养物质的运输为细胞的分化与增值提供更为有益的生活环境;其次,纵向多孔的结构能够规避材料体积较大预冻、冻干不同步导致的孔洞结构分布不均,同时增大了支架整体与基体的接触面积更有利于组织的重建和再生。
附图说明
图1为本发明实施例使用的模具图;图2为本发明实施例使用的模具图;图3为实施例1制备的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的宏观观察图;图4为实施例1制备的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的微观扫描电镜图,图5为实施例1制备的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的微观扫描电镜图;图6为实施例1制备的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料在动物实验中的应用;图7为实施例1制备的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料植入兔子体内进行腰椎融合实验6周(A)和12周(B)空白对照(C)的组织切片HE染色观察图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明,本发明中所有原料和试剂均为市购常规原料、试剂。本发明实施例所用壳聚糖为美国Sigma-Aldrich公司的中均分子量壳聚糖;聚乳酸为美国Sigma-Aldrich公司10万分子量的左旋聚乳酸。本发明实施例所用到的模具,如图1和图2所示,模具中心具有一中心孔洞,中心孔洞周围分布有6个呈中心对称的孔洞,中心孔洞和孔洞的直径约为1mm。本发明实施例中分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量是壳聚糖基体支架在20mlxa0PBS溶液中浸泡10min后用万能压力测试机测得;干态压缩模量是壳聚糖基体支架与聚乳酸复合之后用万能压力测试机测得。实施例1一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法,包括以下步骤:(1)将1mL质量浓度为5%的碳酸氢钠溶液加入到4mL质量浓度为3%的壳聚糖溶液中混合,得到混合液,然后将混合液浇筑到模具中,震荡5min,静置15min,得到初级材料;再将初级材料依次经-80°C储存24h、-70°C冷冻干燥24h、质量浓度5%的NaOH溶液中和、蒸馏水洗涤、-80°C储存24h和-70°C冷冻干燥24h,得到壳聚糖基体支架;(2)将步骤(1)得到的壳聚糖基体支架浸泡于质量浓度为3%的聚乳酸/二氯甲烷溶液中,搅拌30min(500r/min),然后静置6h,最后于35°C、-1atm真空干燥12h,得到所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料。其中聚乳酸溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10倍;聚乳酸/二氯甲烷溶液的体积约为壳聚糖基体支架体积的10倍。其中壳聚糖溶液制备过程:配制体积浓度为2%的乙酸水溶液,称取一定量的壳聚糖粉末(壳聚糖与乙酸溶液的质量比为3:100),慢慢加入乙酸溶液中,室温下磁力搅拌(25r/min)6h,得到质量浓度为3%的壳聚糖溶液。本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料如图3所示,外观为呈乳白色的多孔圆柱体,从图3中可看到:该分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料纵向具有均匀的大孔结构,大孔直径约为1mm。分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的微观结构图如图4和图5所示,从图4和图5中可看到,大孔周围分布有各向的微孔,微孔的直径为2~500μm。因此,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料有利于神经和血管的长成以及营养物质的传输,也有利于细胞的粘附与增殖。经检测,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料湿态弹性模量为0.12MPa,干态压缩模量(与聚乳酸复合之后用万能压力测试机测得)为2.20MPa,孔隙率可达87%。将本实施例所得的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料进行进一步改进,将经过骨诱导的脐带间充质干细胞作为种子细胞,植入支架材料内体外培养一定的时间,通过兔子的脊柱融合实验来对材料的生物学性能进行进一步的测定,如图6所示。图7表示的是对兔子进行脊柱融合实验植并植入复合材料之后6周(A)12周(B)以及不植入材料的空白对照12周(C)的组织切片图,从图中可以看出,在材料植入六周后缺损部位开始有新生骨组织填充在缺损内部,在材料植入12周之后,在缺损区域开始有骨小梁形成。而在空白对照组中,缺损内细胞排列混乱未见骨组织的形成。可见,本发明分级多孔复合材料,通过复合材料与脐带间充质干细胞(UC-MSC)结合,构建具备更高生物学性能的仿生复合体系。在整个的复合体系中,分级多孔复合材料具有开放的空隙和高度的空隙间连接,能够有利于细胞的黏附、增殖以及分化同时也能够为细胞和组织的生长提供特定的空间以及支撑作用,有利于种子细胞核组织的生长。实施例2一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法,包括以下步骤:(1)将质量浓度为10%的碳酸氢钠溶液和质量浓度为6%的壳聚糖溶液以1:5的体积比混合,以500r/min的速度搅拌3min,得到混合液,然后将混合液浇筑到模具中,静置10min,得到初级材料;再将初级材料依次经-80°C储存24h、-70°C冷冻干燥24h、质量浓度5%的NaOH溶液中和、蒸馏水洗涤、-80°C储存24h和-70°C冷冻干燥24h,得到壳聚糖基体支架;(2)将步骤(1)得到的壳聚糖基体支架浸泡于质量浓度为6%的聚乳酸/二氯甲烷溶液中,搅拌45min(500r/min),然后静置12h,最后于35°C、-1atm真空干燥12h,得到所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料。其中聚乳酸溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10倍;聚乳酸/二氯甲烷溶液的体积约为壳聚糖基体支架体积的10倍。其中壳聚糖溶液制备过程:配制体积浓度为4%的乙酸水溶液,称取一定量的壳聚糖粉末(壳聚糖与乙酸溶液的质量比为6:100),慢慢加入乙酸溶液中,室温下磁力搅拌(30r/min)8h,得到质量浓度为6%的壳聚糖溶液。本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料,外观为呈乳白色的多孔圆柱体:该分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料纵向具有均匀的大孔结构,大孔直径约为1mm,大孔周围分布有各向的微孔,微孔的直径为2~500μm。因此,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料有利于神经和血管的长成以及营养物质的传输,也有利于细胞的粘附与增殖。经检测,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量为0.32MPa,干态压缩模量为4.76MPa,孔隙率可达93%。将本实施例所得的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料进行进一步改进,将经过骨诱导的脐带间充质干细胞作为种子细胞,植入支架材料内体外培养一定的时间。材料植入4周复合支架植入组可见由大量新生骨组织填充缺损区域,与周围骨交界处结合尚不紧密,仍可见轻微的裂隙填充材料仍然未能完全降解在之后,在缺损区域开始有骨小梁形成。材料植入8周后材料组可见缺损填充完全,与周围骨交界处结合紧密,已无裂隙可见,已形成正常的骨小梁结构。可见,本发明分级多孔复合材料,通过复合材料与脐带间充质干细胞(UC-MSC)结合,构建具备更高生物学性能的仿生复合体系。在整个的复合体系中,分级多孔复合材料具有开放的空隙和高度的空隙间连接,能够有利于细胞的黏附、增殖以及分化同时也能够为细胞和组织的生长提供特定的空间以及支撑作用,有利于种子细胞核组织的生长。实施例3一种分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料的制备方法,包括以下步骤:(1)将质量浓度为8%的碳酸钠溶液和质量浓度为4%的壳聚糖溶液以1:5的体积比混合,以500r/min的速度搅拌3min,得到混合液,静置10min然后将混合液浇筑到模具中,,得到初级材料;再将初级材料依次经-80°C储存24h、-70°C冷冻干燥24h、质量浓度5%的NaOH溶液中和、蒸馏水洗涤、-80°C储存24h和-70°C冷冻干燥24h,得到壳聚糖基体支架;(2)将步骤(1)得到的壳聚糖基体支架浸泡于质量浓度为6%的聚乳酸/二氯甲烷溶液中,以500r/min的转速搅拌30min,然后静置6h,最后于35°C、-1atm真空干燥12h,得到所述分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料。其中聚乳酸溶液的体积为壳聚糖基体支架体积的10倍;聚乳酸/二氯甲烷溶液的体积约为壳聚糖基体支架体积的10倍。其中壳聚糖溶液制备过程:配制体积浓度为2%的乙酸水溶液,称取一定量的壳聚糖粉末(壳聚糖与乙酸溶液的质量比为4:100),慢慢加入乙酸溶液中,室温下磁力搅拌(30r/min)6h,得到质量浓度为4%的壳聚糖溶液。本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料,外观为呈乳白色的多孔圆柱体:该分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料纵向具有均匀的大孔结构,大孔直径约为1mm,大孔周围分布有各向的微孔,微孔的直径为2~500μm。因此,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料有利于神经和血管的长成以及营养物质的传输,也有利于细胞的粘附与增殖。经检测,本实施例得到的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料最大湿态压缩模量为0.15MPa,干态压缩模量为2.82MPa,孔隙率可达93%。为了将本实施例所得的分级多孔壳聚糖/聚乳酸复合材料进行进一步完善和改进,将经过骨诱导的脐带间充质干细胞作为种子细胞,植入支架材料内体外培养一定的时间,构建成仿生复合体系。在材料植入4周之后,缺损内填充组织细胞为梭形成纤维样细胞,排列混乱,隐约可见骨组织形成,在材料植入8周之后骨髓腔内原有移植材料已大部份被吸收,10周后在缺损区域开始有骨小梁形成。可见,本发明分级多孔复合材料,通过复合材料与脐带间充质干细胞(UC-MSC)结合,构建具备更高生物学性能的仿生复合体系。在整个的复合体系中,分级多孔复合材料具有开放的空隙和高度的空隙间连接,能够有利于细胞的黏附、增殖以及分化同时也能够为细胞和组织的生长提供特定的空间以及支撑作用,有利于种子细胞核组织的生长。上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。